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真相來瞭(le)！爲什麽核酸檢測(cè) “ 假陰性 ” 比例高？

2021/3/9




PCR
疫情中的PCR

随著(zhe)新冠病毒（COVID-19）的全球大流行，截至今天已經造成瞭(le)1億人的累積確診，死亡人數更是超過瞭(le)250萬（https://coronavirus.jhu.edu/map.html）。病毒核酸檢測是診斷新冠肺炎的主要方法，逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）是目前用於臨床核酸檢測最廣泛的方法。雖然RT-qPCR是檢測核酸的金标準，但是其他方法也應用於疫情的防控，其中包括瞭數字PCR（dPCR，digital PCR）技術，相比於qPCR，數字PCR是一項新興的核酸檢測技術，應用於核酸的絕對定量檢測，具有高靈敏度，高精確度的優點。



數字PCR和RT-qPCR核心都是基於聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction），RT-qPCR又是在PCR技術的基礎上進行瞭改進，反應物中添加瞭熒光染料或利用熒光分子标記的探針，通過實時檢測熒光強度計算DNA模闆的擴增量，從而實現對於核酸的定量檢測，實現相對定量的檢測。



而數字PCR基於限定稀釋的概念，将反應體系分割成無數小的反應體系（液滴/微室），每個體系中包含PCR反應的各項成分，經過熱循環反應後對液體的熒光值進行檢測，利用泊松分布計算陽性/陰性的反應體系數量，從而達到對靶标的檢測。相對於RT-qCPR數字PCR不需要校準曲線，其線性數字信号的讀出比qPCR指數放大信号更爲準確，這一優勢使得dPCR在技術上優於qPCR。




雖然，RT-qPCR由於(yú)其技術上的限制以及樣本病毒量的限制，有出現假陰性的概率，已有多篇文獻報道SARS-CoV-2病毒檢測的不穩定性；影響假陰性RT-qPCR結果因素很多，包括瞭(le)引物或靶位點突變，樣本獲取/處理不當，以及樣本中存在擴增抑制劑；而數字PCR屬於(yú)終點法檢測，對於(yú)反應過程中的抑制劑具有較高的敏感性和耐受性，已經被用於(yú)新冠病毒的檢測，以減少假陰性結果發生的概率；已有研究表明，經過RT-qPCR檢測的陰性樣本經過數字PCR檢測爲陽性，表明瞭(le)在低病毒樣本量的檢測中，數字PCR的優於(yú)RT-qPCR，現階段可以作爲其補充。


由於數字PCR的絕對定量特性，即使病毒載量很小，也可以檢測(cè)出陽性樣本（低至數十拷貝(bèi)），而目前疫情防控中，常常要做到如冷鏈産品，各種環境中病毒檢測(cè)，這類檢測(cè)中病毒載量極小，相比之下數字PCR的具有更好的優勢；

此外，由於(yú)新冠病毒屬於(yú)RNA病毒，具有較高的突變率；而數字PCR相對於(yú)RT-qPCR可以更好的檢測樣本的基因突變檢測，商業化的數字PCR系統檢測靈敏度高達0.01％，對於(yú)病毒的溯源和研究提供瞭(le)良好的手段。




PCR
商業數字PCR的發展


1992年，Sykes等人基於(yú)限定稀釋的理論首次提出瞭(le)數字PCR( digital PCR,dPCR )概念；随後的1999年，Kinzler和Vogelstein首次使用“ digital PCR ”一詞發表論文，他們描述瞭(le)通過對樣品進行分區來定量ras突變的方法，以便在微孔闆中進行一系列PCR；而随著(zhe)技術的發展，數字PCR檢測通量進一步擴大；包括瞭(le)在集成流路芯片上進行數字PCR反應，2006年Fluidigm基於這種芯片技術推出瞭(le)第一台商業化數字PCR系統，the BioMark?，該系統基於微芯片設計，具有小的腔室和閥門用於分割樣品和試劑；第一代芯片數字PCR使用陣列芯片，12通道，765分區；2009年，更新瞭(le)第二代芯片，使用48通道 ，770分區，提高瞭(le)吞吐量並(bìng)降低瞭(le)使用成本；同樣是2009年，Life Technologies推出瞭(le)OpenArray? system，該系統採用瞭(le)帶有超過3000μm大小的闆 ，通過表面張力維持PCR混合物；2013年，推出瞭(le)高密度納米流控芯片，可攜帶20000數據點，簡化瞭(le)工作流程，極大降低瞭(le)成本；2014年，Formulatrix推出瞭(le)Constellation system 利用96孔闆微流控系統 ，每孔包含496小室，可單獨進行PCR反應。

此外還有一種基於(yú)乳狀液珠包裹PCR反應物-液滴數字PCR的方法，液滴dPCR的工作流程包括瞭(le)生成含有PCR反應物的水-油微滴，精確調節PCR和油脂化學的設備可以産生數千或者百萬納米升或皮升的均勻液滴，能夠通過微流控通道的快速流動和熱循環過程，而不會破裂或聚合。2011年，Bio-Rad公司推出瞭(le)QX100 Droplets dPCR系統，利用探針法進行檢測；随後推出的QX200微滴式數字PCR系統利用探針和嵌入式染料進行PCR檢測；兩個系統都可以産生大約20000納米級液滴，與早期PCR芯片相比成本極大降低；同樣是2012年，Rain Dance  Technologies推出瞭(le)RainDrop? system可以産生百萬皮升級PCR混合液滴。

數字PCR的工作流程非常簡(jiǎn)單(dān)；在芯片型dPCR系統中，PCR mix，PCR混合物通常在加載設備的幫(bāng)助下分布在預制的隔闆上，裝載的芯片置於(yú)循環加熱器上進行PCR反應，熱循環完成後，使用相機成像芯片對每個分區的熒光強度進行分析，将含有目标分子的分區（正分區）和沒有目标分子的分區（負分區）區别開來；基於(yú)歸一化的熒光強度信号 ，應用一個阈值來分配分區的正負(fù)。一些基於(yú)芯片的系統也會(huì)收集實時的數據，因此可以提供Cq值。




而對於(yú)液滴數字PCR系統，PCR混合物和油通常被移入濾筒的孔中，然後濾筒被轉移到專門設計的儀器中，在儀器中産生油包水乳狀液。液滴乳劑轉移到96孔闆的孔中或管條中的管中，然後放入熱循環器進行PCR擴增；熱循環後，平闆或管被轉移到液滴讀數儀器上 ，液滴被吸入並(bìng)以類似流式細胞儀的方式快速流過熒光檢測器，用於(yú)測量每個液滴中的熒光。根據熒光信号，應用一個阈值将液滴分配到正或負液滴種群中。

數字PCR是一種絕對定量的終點檢測方法，可以提供超靈敏和絕對的核酸定量。這種技術對於(yú)低豐度目标、複雜背景下的目标、等位變異(SNPs)和監測目标水平的細微變化特别有用。随著(zhe)數字PCR技術的發展其應用範圍得到更廣闊的拓展，包括各種病原體的檢測，食品安全監督，水質檢測，微生物生态學研究；由於(yú)數字PCR具有較高的準確度，因此可以檢測出微小核酸分子的數量差異用於(yú)臨床研究，包括生物标志物的開發和檢測；癌症患者基因組擴增窗台和基因變異的檢測；遺傳篩查；基因組編輯，幹細胞中單核苷酸的突變和拷貝數檢測；以及在移植受體這體内檢測移植物來源的DNA和嵌合體；因此領先的研究小組和生命科學工業界開發基於(yú)數字PCR技術的測試，将數字PCR技術用於(yú)分子診斷。


MicroDrop?是由永諾生物研發並(bìng)投入生産的國内首款微滴式數字PCR檢測系統，是我國首款擁有完全自主知識産權的微滴式數字PCR儀，可廣泛應用於(yú)科研、醫療、出入境檢驗檢疫等領域。







References
參 考 文 獻

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